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RESEARCH FRONT

研究前沿

论植物的DNA修复和应激防御能力可否应用于循环肿瘤细胞治疗 C.D. Volko和U.D. Rohr*

论植物的DNA修复和应激防御能力可否应用于循环肿瘤细胞治疗

C.D. Volko和U.D. Rohr*

Endobal医疗研究公司，地址：美国内华达州拉斯维加斯特洛皮卡那大道3006号（1103 E. Tropicana Ave. #3006, Las Vegas, Nevada, USA）1103E，邮编：89119

摘要：综述：研究表明某些特定植物可以降低恶性肿瘤对化疗的耐药性。耐药性抑制细胞凋亡以及其他基本的抗癌保护机制。研究发现大豆可以降低细胞应激并修复由干旱或寄生虫对其造成的DNA损坏，亦可以将防御机制转移到其它植物品种。本研究旨在通过让乳腺癌、卵巢癌及前列腺癌患者口服大豆配方药物FSWW08，来对FSWW08对体外人类乳腺癌细胞株及体内血循环肿瘤细胞（CTC）的基因表达产生的效应进行系统对比。

方法：对人类乳腺癌细胞株BT-474进行体外基因表达研究，该细胞株以单体或株群的形式置于阿霉素或FSWW08之中。卵巢癌、前列腺癌及乳腺癌患者持续服用FSWW08三十天。按照规定方案从他们的血液中提取循环肿瘤细胞（CTC）。在治疗前后分别进行基因表达评估。

结果：在体外，FSWW08降低了多药耐药（MDR）蛋白水平，但阿霉素却增加了其水平。然而FSWW08和阿霉素的联合服用，可以防止MDR上升到生理浓度，同时，如果两类药剂的实验浓度高，也会促成MRD的提升。通过促进细胞分化及新组织形成，体外FSWW08及体内FSWW08可增强几类癌症相关的保护基因的表达，包括肿瘤抑制因子p21、p38和p53。另一方面，体外给药还能提高BAX/BCL比值，以及雌激素受体β、NF-kB、map激酶、c-JUN及基质金属蛋白酶-9的基因表达，同时可以促进CTC中体内VEGF的表达。

结论：当与阿霉素一起体外给药时，FSWW08可以改善人类血循环肿瘤细胞和抗性标志中与DNA修复及应激相关的基因机能。如此，进行更大规模的体外和体内临床研究以调查其他植物中的单一植物化合物，便有了依据。

关键字：Tp53, Tp21, Bax/Bcl2, MAP激酶，VEGF，循环肿瘤细胞（CTC），发酵大豆，多药耐药蛋白，雌激素受体β，NF-KB，RT-PCR技术，人类乳腺癌细胞株BT-474，循环肿瘤细胞、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌

序言

二战期间，美国政府开发出了针对癌症的保护措施[1]。这成为许多通过破坏细胞DNA消灭迅速生长的癌症细胞的类似药剂（烷化剂）的模型，也是化学疗法的发端[1]。

该领域的专家指出，若要提高化疗效果，需要解决两大问题：耐药性和副作用[2-6]。目前正在研究多种新的抗癌方法，包括新的药物、药物的新联合方式、新的药物给药技术以及更精确地将耙向药物送至肿瘤细胞的新方法；首先研究降低副作用的药物，其次是研究可以克服多药耐药性的药物[2-6]。有几位评论家指出，基于植物的某些配方，包括异黄酮、姜黄、维他命A以及中药的某些提取成分，也许能抑制对癌症治疗的耐药性[4]。

有新的理念指出，癌症由与肝细胞相似的一小组细胞发展而来，这表明它们不是全分化的，展示出受损的激素受体表达（图1），且两者都是癌症发展的源头（图2），是促使肿瘤细胞通过迁移进行转移的元凶（图3）[6]。肿瘤干细胞理论对于癌症化疗意义深刻，因为该理论解释了为何化疗对于高分化细胞有效，而对肿瘤干细胞却无效[6]。通过血液系统（循环肿瘤细胞或CTC）或淋巴系统，癌细胞可以更顺利地转移到其他器官（图3）。体外给药的过程显示，植物性天然药剂对控制CTC有显著效果[7]。有几种化疗药剂，虽然可以终止肿瘤快速增长，但对肿瘤干细胞却产生相反的效果，使得它们分裂得更快[8]，并增加应激相关氧类物质（ROS）水平，形成对化疗的耐药性，而某些植物成分则可以降低ROS并降低对癌症治疗的抗应激性[9]。

科学家借用TP53、ATM（毛细血管突变基因）和MEM2（鼠双微基因2）的突变来对人类癌细胞如何经受住增殖、逃避细胞凋亡和基因组不稳定进行解释 [10]。已明确的是，DNA复制压力造成基因组不稳定并导致抑制性凋亡[10-21]。

Steroidal hormone receptor expression in nerve cells-in vitro	神经细胞中的类固醇激素受体表达-体外
Stem cell	干细胞
Cancer stem cell	肿瘤干细胞
Normal nerve cell	正常神经细胞
Schwann	施旺细胞
Progesterone	孕酮
Estradiol	雌二醇
Testosterone	睾酮

图1：干细胞、肿瘤干细胞以及正常全分化施旺细胞中的激素受体分布，引用自[28]

近来，有研究者提出，食物中的化合物，如姜黄素、萝卜硫素、大豆异黄酮、表没食子儿茶素-3-没食子酸酯、白藜芦醇、番茄红素、胡椒碱和维生素D3，可以直接或间接影响肿瘤干细胞的自我更新途径[9]，降低由化疗造成的不利细胞应激，从而使化学治疗更有效[23, 24]。经过长期演化，各种植物生长在经常暴露于多种压力因素联合作用的环境之中，并且因为对各种环境压力的固性依赖而遭受严重的DNA损坏，这些环境压力包括太阳紫外辐射、酵母消化植物、干旱、冻害以及其他大气污染物和土壤污染物，包括重金属和内源过程的代谢副产物[24]。因此，为了在繁复的极端环境压力下得以生存，植物早已演化出检测和修复DNA损坏的高度有效和普遍适用的机制，以消除永久遗传变异的危险和维持基因组稳定性，从而能够准确传递各代之间的遗传信息。[26-28]

图2：浸润性乳腺癌示意图。原发性乳腺癌由两类肿瘤细胞组成。肿瘤干细胞仅有较低的雌激素受体表达，然而原发性癌却由表达62%雌激素受体的肿瘤细胞构成。由于实质上没有雌激素受体表达，化疗、放疗及辅助疗法都不能消除肿瘤干细胞。因此，很难预见是否会发生癌症复发。（见参考[28]）

Circulating tumor cells (CTC) spread from primary tumor

从原发性肿瘤转移过来的循环肿瘤细胞（CTC）

Invasive carcinoma

浸润性癌

68% of all cells ER-аexpression

68%的细胞进行ER-а表达

Disseminated cancer cell in (bloood, lymphe)

（通过血液、淋巴）传播之中的肿瘤细胞

Only 35% of all cells ER-аexpression

仅35%的细胞进行ER-а表达

Metastasis

转移

Cancer stem cell

肿瘤干细胞

Differentiated tumor cell

分化肿瘤细胞

Normal fully differentiated functional cell

正常全分化功能细胞

图3：肿瘤通过其干细胞加速转移，干细胞拥有较低雌激素受体表达并且不会对化疗、放疗和辅助疗法做出反应。

一般情况下，植物性抗癌药物具有毒性，通常会抑制有丝分裂，由用芥子气制造的第一代抗癌药物演变而来且有严重的副作用。此处列出的DNA修复机制跟这种疗法完全不同：它是一个无毒性机制，因为受到环境压力攻击的植物的免疫力已严重受损，无需进一步降低防御机制[25]。压力下DNA修复是一种加强受损害植物的机制。酵母、植物及哺乳动物用于细胞修复和DNA保护的基因都相同，如MAP激酶和热休克蛋白（图4）[25]。在真核细胞中，MAP激酶级联信号通路对于将环境刺激的感知转导入内部信号通路至关重要[30]。植物拥有数量庞大的MAP激酶化合物，可以对大范围的应激反应通路实施控制[31]。有趣的是，在拟南芥中，一种植物特有的独特转录抑制基因Gamma Response 1 （SOG1）负责对DNA损坏修复进行调节，并执行与哺乳纲的tp53类似的机能，该tp53参与了植物对DNA损坏的绝大多数反应，例如转录反应、细胞周期检查点的活化及干细胞的程序性死亡[32]。由于50%以上的肿瘤细胞中不存在tp53，则植物中存在与肿瘤抑制因子tp53类似的一种因子为一项重大发现，该因子为哺乳动物中细胞分化的标志基因因子[33]。对拟南芥及其他多种植物的转录分析显示，相当大比例的基因与DNA损坏修复相关[34, 35]。

Combination of environmental stresses

环境压力联合

Abiotic stress

非生物压力

biotic stress

生物压力

Perception of stress e.g. by somoreceptors, pathogen recognition receptors

感知压力，例如通过渗压感受器、病原体识别感受器

Signal transduction

信号转导

MAP kinase cascades

MAP激酶级联信号通路

ROS accumulation

ROS积累

hormone signaling

激素信号传导

Induction of multiple and individual stress-induced transcription facotrs, e.g. HSF, AP2/ERF, WRKY, NAC, MYB, AREB/ABF, DREB/CBF, Zinc Finger

多应激诱导和单应激诱导转录因子如HSF、AP2/ERF、WRKY、NAC、MYB、AREB/ABF、DREB/CBF 和Zinc Finger（锌指）的诱导

Post-translational recognition of TFs

转移因子的转译后识别

Expression of functional downstream response genes, e.g. LEA protein, heat shock protein, ion channels, genes inolved in lignin and secondary metabolite biosynthesis. ROS detoxification, stomatal closure, growth regulation, cell death

下游功能反应基因的表达，如LEA蛋白、热休克蛋白、离子通道、参与木质素和二次代谢物生物合成的基因、ROS解毒、气孔关闭、生长调节、细胞死亡

Post-transcriptional regulation, e.g. by small RNAs

转录后调节，如通过小分子RNA

Stress tolerance/resistance

抗逆性

图4：因应对生物和非生物联合压力而进行的信号转导通路关键事件（引用自参考[17]）

转录因子受到植物激素和小分子蛋白质的控制（图4）：由于出现水分亏缺和感染大豆绣菌，对大豆miRNA的表达进行了考察，进而发现所有miRNA通常由每种应激从相反方向有差别地进行调节[36]。研究显示大豆也能够影响其他物种如土豆和烟叶的应激反应[37]。大量研究指出大豆可以改变人类肿瘤细胞的基因组[38]。因此本论文系统参考类似研究，考察了体外给药的发酵大豆配方对肿瘤细胞所产生的效应，以及在体内耙向肿瘤患者血液中抽取的CTC的效果，此类考察尚属首次。我们在之前的研究中发现并报告了发酵大豆配方可以提升化疗的疗效，降低副作用并提高存活率[39, 40]。本研究从基因学角度上考察了细胞毒素化合物阿霉素和发酵大豆的联合体外给药是否能够一定程度上抵消传统化疗所产生的副作用。历史上第一次对受到加工植物配方改变的体内血循环肿瘤细胞（CTC）中的应激DNA修复基因进行考察。

试验材料及方法

a. 审查委员会（IRB）

该研究方案经由审查委员会（IRB）审查并已发表【24, 39, 40】。审查委员会通过审查试验的各个方面以保护患者权利和临床试验所涉及人员的安全、健康并批准试验启动。在医师对试验进行说明并宣读详述试验过程及目的的书面知情通知书后，所有患者需在知情通知书上签字。医师应单独告知所有病人，试验是自愿性的，其可在任何时候退出，且无需做出解释。除免费领取药品外，参与试验的患者不能获得经济补偿。该试验遵循现行版本《赫尔辛基公约》的规定。试验数据保存在医院并进行匿名处理以保护患者身份。

b. 体外基因表达调查研究

所有测定基因表达分析的体外试验步骤于此前已有相关叙述【24, 39, 40, 44】，但缺少关于体内体外对照和DNA修复更全面的调查及讨论。已对人体乳腺癌细胞株BT-474进行了调查。该细胞株取自充实状浸潤性乳腺管癌（DSMZ DSMZ保藏号：64，WWW.DSMZ.de），购买于德国微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ，欧盟德国不伦瑞克市茵荷芬街7B号德国微生物和细胞培养物保藏中心-莱布尼兹研究所，邮编38124）。

取10mg盐酸阿霉素溶于5ml水溶剂，其中盐酸阿霉素购于欧盟德国霍尔茨基兴市的德国赫素制药集团（HEXAL AG），邮编：83607。

FSWW08（有机非转基因大豆，Haelan 951），系在中国生产的一种大豆发酵液，由海兰医药有限公司（Haelan Products INC.）进行分销，公司地址：美国华盛顿州（邮编98072）伍丁维尔市142号大道西北F号楼，邮编：18568，www.haelan951.com。试验中的FSWW08系捐赠品，每235ml含250mg大豆异黄酮素。

培养基

根据DSMZ细胞培养数据推荐的条件采用含有胎牛血清（FBS）的洛斯维-帕克纪念研究所（RPMI）培养基。每次实验使用1×105浓度的BT-474肿瘤细胞，在Greiner bio-one购买的24孔组织培养板（Cellstar）上培养。加入试验药物后，将细胞置于培养箱内于37℃条件下培养72小时。

细胞收集过程

按照Quiagen公司推荐的步骤用QIAmp RNA 采血迷你套件收集细胞以获取总RNA。用Quiagen公司RLT裂解缓冲液对沉淀细胞进行低温和干燥冷藏保存工序以获取细胞。通过QIA-细胞粉碎机和QIA-自旋列对RNA进行进一步分离。通过逆转录作用对含RNA的洗脱液进行测定。利用随机六聚体和小鼠白血病病毒（MMLV）逆转录酶进行上述反应，以将RNA反转录成cDNA。

基因表达分析

通过定量实时RT-PCR技术对mRNA的基因表达进行测定。用美国应用生物系统生命技术公司（ABI，地址：美国纽约格兰德艾兰市史达利路3175号，邮编14072）的序列检测仪7700进行基因表达测定。采用ABI公司研发的5´-核酸酶测定，此方法依据为将cDNA定量测定的结果作为mRNA的同等数量。出于定量目的，每次基因表达分析以包含mRNA作为标准的细胞株做对照组。对照细胞株的稀释比列为1:10。

以部分对整体cDNA 2×106的关系进行分析。从实时RT-PCR获取的数值即为细胞平衡浓度(CEQ)。所有测量结果一式三份。

基因表达分析的测量与GAPDH相关并使之标准化以在两者间进行对照。额外的处理方法为将所有获取的数值标准化成1，作为未经处理的肿瘤，以便将相关的基因表达以数字表示。

试验物质剂量

用于肿瘤单药疗法的阿霉素通常剂量为 50 - 80 mg/m2 身体表面积。成人平均身体表面积为2 m2。注射液含2μg 阿霉素/μl。成人平均血量为 5 - 7 升。FSWW08的剂量为每天一瓶 236 ml，一半剂量 118ml，一天两次。对物质进行单独及组合测试，并与未处理的细胞株进行对比。对不同浓度下的基因表达参数 (BCL2, BAX, TopoII, MDR1, ERBB2 及其他, 表2)进行测量。需要解答的问题如下：

a) 阿霉素单药疗法对乳腺癌细胞株BT-474相关的基因表达的影响是什么？

b) 阿霉素和 FSWW08 的联合使用对细胞株BT-474的基因表达的影响是什么？

c) 阿霉素与FSWW08联合使用是否能获得单独使用阿霉素时对 BT-474产生的相似结果？

d) 从患者身上提取出的血液内流通的肿瘤细胞的体内基因表达。

患者特征

对5位卵巢癌患者、5位前列腺癌患者和7位乳腺癌患者（pT1 to pT4, pN0 to PN2, Mo）进行了试点研究。

血液抽样

在使用治疗物质之前，用S- Monovette® （德国宁布雷希特市莎斯特两合公司（Sarstedt AG & Co））收集两份5ml乙二胺四乙酸酸性血液试样以进行CTCs分离，并在4°C条件下保存待进一步研究。血样应在提取后立即或最晚4个小时后进行处理。额外收集一份血清样本以测定血清肿瘤标志物。

从血液中提取癌细胞及肿瘤细胞

方法在[40]中叙述。

基因表达测定方法

以上描述的是体外的方法，使用的是同样的试验方案及仪器。本文采用的最低检测标准为每5ml[41]两个细胞添加同位素示踪剂。对健康捐赠者血样（n = 20）检验显示出95%的特异性, 验证了文献中的数值[10]. 我们在所有卵巢癌（100%）、所有前列腺癌（100%）及7位患有乳腺癌CTC的女士当中的5位（71%）均检测到, 较文献中所列数值要高[41]。

c. 从患者血液中提取的CTC的基因表达

我们将基因表达的结果与两次临床试验联系起来，在试验中我们调查了a)存活期超过4年的中间试验[40] 及前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌患者的健康状况，和 b)多研究中心268位患者[39]的空白对照临床试验。我们将FSWW08与酪蛋白溶液进行对比。除恶病体质患者之外, 分析了其他人的白血球数量及其他血液参数。文献中列有患者特征[39, 40]。

统计评估

一次t-检验对比了两组使用的方法。例如，对比对照组和治疗组相关基因表达是否不同。t-检验对比了两组的一个变量。t-检验（以及相关非参数分析实验)确切对比了两组。使用软件为2014版，来自GraphPad Software公司, 地址为：美国加州拉荷雅镇费伊大道7825号230号套房，邮编：92037。

结果

单独调查了阿霉素和FSWW08对BT-474细胞的GAPDH基因表达的影响，并与未经处理的BT- 474细胞进行对照（表1, 图5）。阿霉素和FSWW08 均减少了BT-474的细胞形态和基因表达（表1, 图5）。阿霉素: GAPDH的表达在低浓度DOX减少 50%，而在高DOX浓度时则减少超过90%。这意味着大大减少肿瘤细胞的存活数量（表1, 图5）。FSWW08: 与未经处理的肿瘤细胞相比，FSWW08 导致GAPDH基因表达减少了5倍，降幅多达10倍。这意味着FSWW08对肿瘤细胞存活数量有着重大影响。阿霉素和FSWW08 均视为具有细胞毒性（表1, 图5）。

表1：由FSWW08引起的体内、体外基因表达变化一览表。对取自细胞株BT-474的标准数量的细胞进行体外研究，该细胞株购自德国国家生物材料资源中心（德国不伦瑞克市茵荷芬街7B号德国微生物和细胞培养物保藏中心 -莱布尼兹研究所，邮编38124。）

基因	功能	细胞株BT-474	乳腺肿瘤循环肿瘤细胞	前列腺肿瘤循环肿瘤细胞	卵巢肿瘤循环肿瘤细胞
GADPH	GAPDH是一种管家基因，其在肿瘤细胞和健康细胞中的基因表达是相等的。因其仅在活体细胞中表达，常用于基因标准化和量化。GADPH减少意味着细胞死亡[42]。	-80%	-18%	-22%	-19%
GADPH		(± 4)	(± 3)	(± 4)	(±4)
BAX	BAX是一种促凋亡线粒体膜蛋白。其抑制Bcl2基因并加速程序性细胞死亡（细胞凋亡）。涉及Bcl2基因的BAX表达减少与对5-氟尿嘧啶、表阿霉素和环磷酰胺的无反应有关 [47]。	高达4倍	无变化	增加8 至 60倍	无变化
Bcl2	Bcl2为抗凋亡线粒体膜蛋白进行编码。Bcl2在许多肿瘤中过度表达，因此引起对促凋亡药物的耐药性（例如，嵌入剂、烷化剂、铂类化合物）。	低浓度无变化	无变化	无变化	无变化
ERBB2	Erbb2（又名HER2/neu）是一种细胞增殖分化过程中的酪氨酸激酶。肿瘤的Erbb2过度表达可使用赫赛汀治疗（一种Erbb2抗体）。	低浓度无变化	无变化	无变化	无变化
MDR1	多药耐药性1（MDR 1）是一种糖蛋白，可以将抗癌药物运输至细胞外。肿瘤细胞MDR1过度表达将对多种药物例如长春花生物碱、蒽环类药物、紫杉烷类药物或丝裂霉素C产生耐药性。	-44 %	- 25%	- 31%	-33 %
MDR1		-44 %	(±6%)	(±6%)	(±5%)
Tp21	在应对多种刺激时，激酶抑制剂p21（又名P21^WAF1/CIP1）可使细胞周期停滞。它随时可作为抗恶性细胞增生多信号的感应器和效应器。	增加8倍	增加6倍	增加22倍	增加6倍
tp53	tp53是一种肿瘤抑制基因并可以调节细胞周期。p53中的基因突变是人类恶性肿瘤基因变异中最频繁的突变。因此p53的基因变异（突变、杂合性缺失、表达）被用作分子标记物。	增加2,4倍	增加18倍	增加16倍	增加150倍 [57]
c-jun	c-Jun是一种免疫标记，在多种过敏和炎症反应中出现。	-55%	-54%	-62%	-22%
c-jun	c-Jun是一种免疫标记，在多种过敏和炎症反应中出现。	(±16%)	(±22%)	(±36%)	(±12%)
雌激素受体β	雌激素受体β与前列腺癌的相关性很小，但是其对于乳腺癌和卵巢癌意义争议较大。	增加 80% (±41%)	增加80倍	增加82倍	增加72倍
雌激素受体α	缺乏它莫西芬的拮抗，经典雌激素受体与乳腺癌发生有关。	无变化	无变化	无变化	无变化
拓扑异构酶IIα	拓扑异构酶IIα可以在DNA复制过程中催化DNA双链控制性断裂和重新连接。拓扑异构酶II抑制剂（蒽环类药物、米托蒽醌、依托泊苷）诱发拓扑异构酶II的异常作用，致使DNA损伤。若拓扑异构酶II在肿瘤细胞中表达不足，DNA损伤减少，治疗失败。另一方面来说，拓扑异构酶II过度表达增加了细胞对拓扑异构酶II抑制剂的敏感度。	-34% (±6%)	ND	ND	ND
VEGF	血管内皮生长因子（VEGF）在许多肿瘤中属于正调节，通过内皮细胞的旁分泌刺激促进新生血管生成。肿瘤细胞中VEGF的高表达水平与对它莫西芬的激素治疗以及使用FAC或CMF的合并化学治疗的低反应相关。新的抗癌剂例如贝伐单抗（阿瓦斯丁）特别针对VEGF起作用。	未定	± 0 %	增加37倍	7,6倍

图5：细胞株BT-474的 GADPH表达的阿霉素和大豆发酵（FSWW08）的效应。未经处理的细胞的GADPH基因表达为1。

图6：c-myc、Bax和Bcl2在细胞凋亡过程中的作用。c-myc：为转录因子编码的调节基因以及在许多癌症中发现的突变基因。NF-kB：控制DNA转录的蛋白质复合物，在应激、免疫和癌症中十分重要。

抗凋亡BCL2基因表达变化（图6）：阿霉素：阿霉素对BCL2的表达产生的效应十分强烈。随着阿霉素的浓度增加，BCL2表达值减至未经处理的BT-474肿瘤细胞中发现的表达值的10%以下（仅限于报告值）。FSWW08：FSWW08在低浓度时对抗凋亡BCL2表达值的调整无影响（表1）.

BAX基因表达（表1，图7）。阿霉素对促凋亡BAX表达产生的效应很低（在此未展示仅报告）。FSWW08在细胞株BT-474上的使用提高了促凋亡（图6）BAX的表达，甚至BAX表达的提高程度更高：与未经处理的肿瘤细胞相较接近4倍。

拓扑异构酶IIα基因表达（药剂浓度增加）：阿霉素导致拓扑异构酶IIα基因表达增加了1.8倍，在高浓度时基因表达再次降低（表1）。拓扑异构酶IIα基因表达显示其值仅为未经处理的BT-474细胞的0.6倍。FSWW08并未引起拓扑异构酶IIα增加。相反，其最多减少了0.3倍（表1）。

MDR1（多药耐药性）基因表达（表1，图8），肿瘤耐药性的标记。阿霉素增高导致MDR1基因表达显著增高，MDR1基因表达高达17倍。相对于未经处理的肿瘤细胞而言，在低浓度FSWW08中的表达降低了40%。

图7：阿霉素和 FSWW08对乳腺癌细胞株BT474 中BAX基因表达产生的效应。未经处理的细胞的BAX基因表达为1。

MDR1 relative gene expression （untreated equal 1）	MDR1 相关基因表达（未经处理的细胞相当于1）
In vitro chemo （induction by Doxorubicin alone）	体外化疗（仅由阿霉素诱导）
Inhibition in combination	联合抑制
fermented soy（FSWW08）	大豆发酵液（FSWW08）
Untreated	未处理

图8:阿霉素和大豆发酵液对乳腺肿瘤细胞株BT474的MDR1基因表达（多药耐药性）产生的效应。MDR1是一种细胞膜蛋白，可将物质排出细胞外。未经处理细胞的MDR1基因表达为1。上方图片添加了阿霉素，下方图片添加了阿霉素且FSWW08的浓度不断增加，均以X轴表示。

阿霉素和FSWW08联合治疗

阿霉素浓度为10时（低浓度），随着FSWW08浓度不断增加，MDR1基因表达也增加。阿霉素浓度为10/FSWW08浓度为60时，可能达到相当于单独使用浓度为60的 FSWW08时的基因表达程度。相对于单独使用阿霉素治疗，浓度为100的阿霉素（高浓度）与浓度为10的HAL联合用药时，其效果较好。增加FSWW08的量（浓度分别为10、 30、 60 ）可减少MDR1基因表达。浓度为60 的FSWW08的疗效增加了3 - 4倍，而单独使用浓度为100的阿霉素治疗时疗效增加17倍。显然，两种药剂中有一种药剂对MDR1基因的影响比较大。若阿霉素和FSWW008以平均浓度给药，MDR1基因表达无增加。这意味着处于低生理浓度时，大豆发酵液（FSWW08）消除了由阿霉素引起的耐药性。

ERBB2基因表达

仅使用阿霉素致使ERBB2表达持续减少（在此未展示仅报告）。在低浓度时，阿霉素仍为未经处理的BT-474的0.7倍以上，更高浓度的阿霉素使该受体酪氨酸激酶减少10倍（表1）。

雌激素受体α和β基因表达

雌激素受体α是描述乳腺癌风险的经典雌激素受体α。如表1所示，FSWW08并未更改雌激素受体α基因表达，但在统计上雌激素受体β的基因表达显著增加（图9）。

图9:对前列腺癌患者的循环肿瘤细胞（CTCs）进行ER-α（雌激素受体-α）和ER-β基因表达分析，n=6（平均值以及标准差）。星号表示差异具有统计学意义（P达到5%）。

自癌症病人血液提取的循环肿瘤细胞基因表达研究（表1）。表1对通过口服大豆发酵液FSWW08 三个月后获得的几种基因表达调查结果以及体外细胞培养基因表达所呈现的结果进行了比较。雌激素受体α和β（图9，10）:与体外试验一致，雌激素受体α在前列腺、卵巢以及乳腺癌的循环肿瘤细胞中并未增加，但雌激素受体β增加了（表1）。

BAX / Bcl2 基因表达

前列腺癌症患者体内的循环肿瘤细胞的BAX / Bcl2表达比率的增加量达到了统计学意义，然而体内卵巢和乳腺癌中并未有明显变化（表1，图11 - 13），这表明FSWW08提高了前列腺癌中的循环肿瘤细胞的促凋亡状态。BAX在体内乳腺癌细胞中增长，也表明其促凋亡效应（表1）。

图11:服用FSWW08（大豆发酵液）后，前列腺癌患者的循环肿瘤细胞的凋亡促进基因BAX/BCL2的基因表达比例上调。

GAPDH基因表达:自乳腺、前列腺和卵巢癌患者身上提取的三种不同循环肿瘤细胞的GAPDH基因表达均下降（表1），尽管有些比体外少。

Tp53基因表达

tp53的蛋白功能被认为是细胞修复的守护者，控制癌症的许多重要标记，并能控制细胞周期（图14）以及细胞凋亡。许多癌症中已检测到Tp53的突变以及基因表达缺失。人们发现，体内和体外的循环肿瘤细胞的tp53的基因表达均增加了（表1，图15）。循环肿瘤细胞的tp53基因表达增加非常明显，表明在体内，无论是在CTC内产生其它机理还是服用大豆发酵液均可能引起其他效应。如图15所示，tp53基因表达在几年内维持不变。

图12:服用FSWW08（大豆发酵液）后，乳腺癌患者的循环肿瘤细胞的凋亡促进基因BAX/BCL2的基因表达比例无变化。（平均值和标准差）。若显著水平为10%，则平均值未达到统计学意义。

图13:服用FSWW08（大豆发酵液）100天后乳腺癌患者的循环肿瘤细胞的凋亡促进基因BAX/BCL2的基因表达比例无变化。（平均值和标准差）；（n = 5）。若显著水平为5%，则平均值未达到统计学意义。

Tp21 基因表达

Tp21是一种关键蛋白质，对细胞修复控制凋亡和控制细胞周期均有重要作用。其可能与tp53一起作用，对控制癌症起到重要作用（图14）。Tp21在体内和体外循环肿瘤细胞中的增长十分明显。FSWW08对所有肿瘤的循环肿瘤细胞产生的效应无疑比体外更明显（表1，图16 - 18）。

丝裂原激活蛋白激酶

乳腺癌细胞中的MAPK的基因表达（图19）可为FSWW08所更改。此外，癌症炎症减少的症状可用传统染色技术检测，从而证实基因表达的结果（图20）；检测时对一名乳腺癌病人的病理组织样本进行切片染色。传统染色技术证实了肿瘤有利于提高免疫这一基因发现。

图14:肿瘤抑制因子p21和p53之间的关系示意图，以及各自在细胞凋亡和细胞周期进程中的作用

图15:与未经处理的细胞、与1.5个月之后、3个月之后以及4年之后的基因表达相比，卵巢癌患者的血液循环癌细胞的相关基因表达变化。（A）前列腺癌患者，（B）乳腺癌患者，（C）卵巢癌患者。数字表示患者数量。出自参考文献[11]。以5%为显著水平，用药后所有平均水平均达到统计学显著水平。

图17:乳腺癌患者血液循环肿瘤细胞的肿瘤抑制因子p21的基因表达（n=7）

c-Jun基因

哮喘或过敏反应中细胞因子细胞内释放与局部免疫细胞的c-Jun激酶增长、p30 MAP-激酶和NFKB相关[12]。第一代抗组胺对FSWW08具有类似的免疫调节反应，且地塞米松具备类似的能力，可以更改骨髓瘤细胞、前列腺、乳腺和卵巢癌的p38、MAP激酶、c-Jun和NFKB的基因表达[40]。乳腺肿瘤循环肿瘤细胞的c-Jun的减少证实了免疫力增强的结论（图19）。

人们认为，患者血液中的肿瘤坏死因子α下降（图21）是由于不断改善的屏障功能引起的，因为较大的分子不能渗透细胞屏障（图22）。因服用大豆发酵液而导致的恶病质减少（图23），很可能与不断得到改善的屏障功能相关，由基质金属蛋白酶9基因表达的增加证实了这一点 [24]。

The influence of fermented soy consumption on MAP-Kinase cascade gene expression on CTC extracted from blood of mamma ca patients

大豆发酵液对乳腺癌患者血液中的循环肿瘤细胞的MAP激酶级联基因表达的影响

Untreated

未经处理的细胞

Phospholipase cβ（PLCβ）3

磷脂酶Cβ（PLCβ）3

Full-length H-Ras protein

H-Ras全长蛋白质

p21/ras activated

p21/ras激活

K-Ras Oncogene

K-Ras致癌基因

Mitogen-activated protein/ERK Kinase 3 （MEKK3）

促分裂原活化蛋白/ERK激酶 3 （MEKK3）

P38 MAPK Pathway

P38 丝裂原活化蛋白激酶通路

Stress activated pathways

应激活化通路

Myelin basic protein （MBP）

髓鞘碱性蛋白（MBP）

C-jun, a major transcription factor

C-jun，一种重要的转录因子

Growth and mitogenesis

增长和有丝分裂发生

Apoptosis

细胞凋亡

Treated with FSWW08

使用FSWW08一起治疗

MAP-kinase-casecade in CTC in pooled blood of breast cancer patients

乳腺癌患者池化血CTC中的MAP-激酶-级联

A-Raf

图19:大豆发酵液（FSWW08）引起的乳腺癌细胞的血液循环肿瘤细胞的基因表达变化。细胞取自池化血。（no change:无变化）

血管内皮生长因子（VEGF）基因表达

如图24所示，自前列腺和卵巢癌患者身上提取的CTC检测到血管内皮生长因子基因表达增加。

临床疗效

癌症患者的胃口和免疫状态均大大削弱。临床研究中同时对大豆发酵液FSWW08（A组，口服FSWW08）以及安慰剂（B组）进行测试；测试在六所癌症医院进行，在那里癌症患者接受放射治疗或化学治疗（进行放射治疗的患者n=78，进行化学治疗的患者n=184，共计262）[39]（图23）。

图20:38岁妇女乳腺癌组织样本。第一排图片是在服用大豆发酵液之前的样本，第二排是服药14天后的样本。“H&E”指苏木素伊红。苏木素伊红染色通常用于常规组织准备。伊红是一种酸苯胺染料。其将与基本结构（或带负电荷的结构）结合并染色，例如蛋白质上的阳离子氨基酸组。其可将这些结构染成粉红色并可解释DNA活性，失去颜色即意味着DNA活性减少。Folkman的文章中将F8作为血管标记[79]。KI67是抗血管生成的常见标志。详见参考文献[38]。

Permeable capillary membranes surrounding the tumor	肿瘤周围的渗透性毛细血管膜
Cytokines pokeholes into capillary membrane	进入毛细血管膜的细胞因子
Tumor	肿瘤
Immune cells	免疫细胞
Tumor cells	肿瘤细胞
Cytokines	细胞因子
Cytokines from tumors in the blood	血液中的肿瘤细胞因子
Disseminated tumor cells in the blood	血液中的播散肿瘤细胞
Metastasis	新陈代谢
Cachexia	恶病质
Psychological distress	心理健康
Sarcopenia	肌少症
Drug resistance	耐药性
Inflammation	炎症
Recurrence and progression	复发和进展
Depression/Fatique	抑郁/疲劳
Cognitive impairment	认知障碍
Stomach	胃
Joint pain	关节痛

图22:癌症细胞因子概念模型。癌症细胞和免疫细胞是细胞因子的来源，细胞因子可以支持癌症发展并导致心理行为症状（疲劳、抑郁和认知障碍）、药毒性、耐药性、厌食、恶病质、疼痛以及癌症复发和进展。遗传背景、癌症治疗以及心理健康可以证实细胞因子的产生。癌症幸存者的极度活跃的免疫细胞是心理行为症状的细胞因子的主要来源。出自参考文献[28]。

图23:接受化学治疗的癌症患者每日服用大豆发酵液对食欲丧失（恶病质）造成的影响，对照组接受含酪蛋白安慰剂溶液治疗。这是一个双盲研究，参见[27]。

A组经历了淋巴细胞转化率显著增长，B组则无此类经历（表25）。配方A组大大抑制或削弱了白细胞数量减少的情况，然而安慰剂组发现大量白细胞减少的情况。A组的血红蛋白和血小板减少的情况得到缓解，尽管并不是十分明显[39]。A组的患者无需进行任何输血，然而安慰剂组在进行化学治疗的时候进行了输血（图24）。A组的食欲丧失率从57.9% 降至 13.3%。而在安慰剂组，在接受化学治疗和放射性治疗时食欲丧失率提升了，从41.8% 升至 70.9 %（图26）。该研究在中国进行，但是在美国哈佛医学院也得到了类似结果[44]。

图25:进行化学治疗与FSWW08联合治疗、FSWW08与山药根联合治疗或酪蛋白安慰剂溶液治疗之前（灰色方块）和之后（黑色方块）的白细胞平均数和标准偏差。虚线为正常范围的最小值。

**指误差显著水平为p < 0.01时的统计上的显著差异。参见[27]。

在小型试验研究中，服用FSWW08的卵巢癌患者的存活率比采用一般疗法的患者高，尽管在统计上这种差异并不十分明显[40]。所有服用FSWW08的前列腺癌患者都仍存活[40]。乳腺癌患者的存活率提高了，且服用FSWW08的存活率可以与乳腺癌患者中具有高肿瘤抑制因子p53基因表达的患者相联系。这证明服用FSWW08的癌症存活率比不服用者高。

讨论

世界卫生组织（WHO）报告，癌症造成的死亡人数占全世界死亡数的63%，占西方国家死亡原因中的第二位[45]。癌症是一种复杂的基因疾病，其突变可在多个细胞信号通道进行[46]。大多数癌症都有这两种特点:基因组不稳定性以及突变肿瘤促使周围组织发炎，因此肿瘤可以侵入周围的组织[47]。肿瘤化学疗法大多数采药剂抑制有丝分裂或通过其他细胞毒性机制，例如阿霉素[48]。近年来人们才发现植物调节细胞生长的方式与动物和人类的相似[78]。动物在进化生长过程中才慢慢产生其他基因调节化合物例如甾体类激素，雌二醇是第一种甾体类激素（随后变化为激素级联[79]）。

图26:癌症侵蚀组织与寄生虫寄生在植物叶子上这两种类似方式的比较示意图。

植物通过DNA修复机制保护自身应对寄生虫的生长，在机理上与肿瘤向周围组织生长相似（图26），这种机制定义为环境产生的生物应激[29]。有趣的是，肿瘤可能在机理上定被义为多余的入侵者，因其对组织环境施加压力以促进其成长（表2，图26）。直到最近，植物科学家才揭示了多种农业植物通过相似修复DNA机制保护自身应对环境产生的干旱应激、受损酵母或寄生虫，这种机制也存在于人类中，如MAP激酶（表2，图4、19）。激素及小分子RNA主动更改植物内的基因组并有能力在其他种类进行此种行为，因为经证实大豆也可将防御基因组机制转移至其他植物种类，这也就提出这种机制是否可以对抗癌症的疑问[37]。

表2:对照在植物中描述为细胞修复基因并在植物生物学中测定的基因，将细胞基因标记和与癌症相关激素进行对比。大豆中除VEGF类基因和蛋白质外的所有基因均可测定。除酵母之外，在几乎所有具有较大组织的种类中均发现这一点。说明详见正文、文献引用及图4。

植物生物应激防御	人类癌症标记
伽马反应抑制蛋白1（SOG1）	Tp53，Tp21人类癌症
通过谷胱甘肽过氧化酶、苯丙氨酸解氨酶（PAL）及 PR - 1，基因控制NO生产（参考文献[81]）	IKK/NFKB-类信号通路
BAX	BAX
胱氨酸结超家族VEGF/PDGF（血小板源生长因子)组。（参考文献[80])	VEGF
MAPKinase[30]	MAPkinase
基质金属蛋白酶（MMP（参考文献[29]）	MMP
c-JUN	c-JUN

该试验中讨论的发酵大豆液减少了经受创伤后应激障碍（PTSD）士兵的精神压力，这一效应强烈及持久，由这一事实可说明应力修复机制的临床重要性及对化疗的差异[49]:严重的精神压力是PTSD的一个特征，而细胞压力和精神压力是相关联的[50]。同样的大豆发酵液在人类临床试验中用以稳定肌萎縮性脊髓側索硬化症（ASL），其在定义上为渐进的细胞疾病[82]:尽管未能完全恢复正常，但是在过去几年首次出现可以阻止渐进式状态的情况。如上所述，通过非生物及生物应激反应的这一植物修复细胞机制无毒，且在癌症多中心试验研究及ASL试验未见副作用的报道，它们进行试验使用的大豆发酵液与该体外基因表达研究试验中一致。

作者先前也已就癌症患者精神及细胞应激反应临床效果改善进行叙述，对大豆成分异黄酮染料木素的调查发现每天服用1000 - 1200mg[51]的大豆原料异黄酮染料木黄酮可增加患者存活时间，使其得到更好的生活质量并减少癌症化疗的副作用。我们此前也提到大豆发酵液（FSWW08）可减少应激和改善士兵健康状况，提高患者生活质量，减少恶病质（图22），并减少癌症治疗的副作用，如恶病质（图23）和白细胞减少症（图25），增加癌症患者的存活时间[40]。

通过对比对取自癌病患者血液的癌瘤细胞（CTC）产生的效应和经具有细胞毒性的阿霉素处理的体外细胞株（表1）直接对照FSWW08液基因表达改变。在同一实验室使用相同的方案和方法进行基因表达。另一方面，癌症病人CTC和体外乳腺癌细胞株并非来自同样的捐赠种群。此外，CTC亚群可能会有不同性质，因为癌症细胞具有形成微转移癌的能力，且转移瘤极有可能源自CTC，就医疗需求上看，亟需开发新的方法将CTC[11]的基因型及表现型归类。尽管我们未调查人类的CTC是否存在亚群，但大豆发酵液液造成的改变已确认。

CTC中发酵大豆液和乳腺癌症细胞株BT的基因表达癌症标记的对比表明在体外细胞株和CTC中（表1）抗癌效应以相似方式增多，如BAX增多，tp53、c-Jun、tp21增多，MAP激酶沉寂增多。该调查证实其他体外调查员对大豆成分调查的结论，即体外tp53基因表达[51]、MAP激酶[52]，NF-KB[38]，基质金属蛋白酶[53-55]有所改善。

该调查具有独特性，首次再现患者血液提取出的循环肿瘤细胞的基因表达，并额外与植物基因科学领域的新发现[表2]联系起来，即植物拥有在受到压力时未使用任何毒性机制即可进行细胞修复的机制。

CTC中tp53和tp21基因表达同时增加，此为一项重要发现，验证了大豆发酵液的强力细胞凋亡效应，因为tp53减少细胞周期，增加细胞修复并减少细胞应激（图14）[56，58]。Tp53的更改与缺失被视为癌症细胞的特征之一，在全部癌症患者中约有50%缺少Tp53[51]。显然，体内外有别:体内CTC细胞区别较少，因此tp21和tp53基因表达增加比体外更为明显（表1）。Tp53也与白血球形成凋亡增多有关[56]，这一点可见于我们的临床试验中（图24）。近来才发现植物的tp53确实呈现出相似修复基因以克服环境压力[29]。

我们和其他人所记录到的因大豆基质金属蛋白酶基因增加而导致屏障功能的额外改善[39，55]，结合免疫力显著增强可很好解释减少的癌症副作用（图20），通过抑制细胞激素从肿瘤释放到血液（图23），也修改了肿瘤中被视为驱动癌症细胞生长及转移的癌症干细胞（CSC）。改善植物屏障功能是植物的一种重要机制以保护自身免受寄生虫，伤害或伤口，在应用于人类时仍可能保留其能力。

特殊的FSWW08大豆发酵液的确增加了前列腺和卵巢癌症病人的CTC中VEGF基因表达（表1，图24）。VEGF前体未在酵母中确认，但在几乎所有其他形成更大组织的种类已经确认（表2）[80]。

抗-VEGF治法用于抗癌治疗中的设想和局限现今在研究者中争议颇多，因其对乳腺癌无效，用以治疗神经胶母细胞瘤时可能有了获得性耐药性，可能增加了神经胶母细胞瘤的侵袭性[59]。VEGF为人类细胞应激的一个标识:若氧气消耗量低，则VEGF在孕期增多以促进胎儿血管发育及提供氧气[61 - 64]。VEGF有助于减少细胞应激。如图20所示，服用大豆发酵液FSWW08后血管再生标志和DNA活动的减少在乳腺癌组织中得到确认。血管再生减少及改良的屏障功能得到改善（图22），阻止细胞激素扩散进入总血流（图21），细胞激素会造成抑郁、炎症、疲劳、尤其是恶病质和食欲不振（图22）。

阿霉素和大豆发酵液均对人类乳腺癌细胞株BT-474有细胞毒杀效应（表1）。两种物质使用高剂量时增加了MDR1表达，其中阿霉素的作用更明显。使用生理学上的低剂量时，大豆发酵液与阿霉素联合治疗减少了多药耐药基因MDR1。

在体外试验中，FSWW08引起癌症中促凋亡基因BAX[64，65]表达提高（图７），而传统化学治疗剂阿霉素未改变该基因的表达，这一事实表明FSWW08和阿霉素联合治疗以求更有效的治疗癌症方法至少是有益处的。FSWW08增加了取自前列腺癌症患者血液的CTC里的BAX（图11），但却未改变从卵巢和乳腺癌患者提取的部分（图12、13），这一原因未知。在生长或发病过程中，设置程序性细胞死亡以减少无用或多余的细胞，这一点与植物和动物相似[66，67]。植物和动物中导致细胞死亡的共同路径未被证实[68，69]。在植物中，触发细胞死亡以应对入侵性病原体而导致在感染区域附近形成死细胞区域[70]。这种与杀死宿主细胞的情况通常与抵抗病原体增殖和扩散有关[71]。烟草花叶病病毒即为一种典型的植物寄生虫并导致宿主细胞在病原性入侵者附近死亡，以阻止其进一步进入细胞。Bcl-2/BAX杂二聚体基因控制酵母和植物中细胞的死亡和生存[72，73]并组织植物的预防应对入侵者[74，75]。

核因子活化B（NF-KB）家族转录因子系应对伤口或感染中的免疫和炎症过程的主调控因子[76]。NF-KB不存在于植物细胞中，但是直接前体级联可在植物中找得到，调控NO生产，因此在植物生理学中它是一重要的因子[81]。多位研究者均表明许多植物可以减少人类组织和细胞中的NF-KB，大豆发酵液也表明了这一点[77]。

鉴于需要进行更大统计数据的相关试验，这些包含FSWW08的体外和体内试验中无法得出任何临床相关的健康证明。但，可建议将DNA修复的植物源药物结合那些DNA毒性机理研究进行更多研究。试验的液对习惯西方饮食的患者来说并不可口。除了异黄酮素之外还有哪种成分引起了该研究所述的基因改造，也需要进行研究。

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