研究报告 Haelan 951和阿霉素联合治疗乳腺癌细胞株BT474的疗效
2021-04-07 10:33:58
研究报告
Haelan 951和阿霉素联合治疗乳腺癌细胞株BT474的疗效
作者Doris Bachg, 医学博士,哲学博士;Uwe Haselhorst 医学博士
前言
研究目的
本研究旨在明确Haelan 951和阿霉素联合治疗对乳腺癌细胞株BT474的作用。分析的重点在于这些物质是如何在治疗中改变所选基因的表达。本研究承接此前在雷克林豪森的Gemeinschaftspraxis进行的研究,当时对4种不同的肿瘤细胞株使用了Haelan 951。本次研究应该阐明下列问题:
·阿霉素单独用药对培养BT474细胞选定基因表达的作用。
·阿霉素和Haelan 951联合使用对BT474细胞选定基因表达的作用。
·和Haelan 951联合使用时,是否可以减少阿霉素用量但依然获得高剂量阿霉素单独用药的疗效。
阿霉素特点
阿霉素在药理学上是具有细胞抑制剂作用的抗生素,属于蒽环霉素类,用于转移性乳腺癌和其它各种肿瘤的化疗。蒽环霉素是DNA嵌合物质,还会影响拓扑异构酶II的作用。拓扑异构酶是在多个DNA功能中(包括转录、复制和重组)调节DNA拓扑结构的核酶,由DNA链的裂解和调控介导。这样的干涉会导致致命的DNA损伤,如DNA链断裂(Wiese L,2001)
增值速率高且修复功能受损的肿瘤细胞对细胞抑制剂尤其敏感。但是这些药物也会伤害快速增殖的正常细胞,比如骨髓细胞或毛囊细胞,这样会引起严重的副作用。另外,诸如阿霉素的蒽环霉素类药物都有致突变作用和致畸作用。
Haelan 951的特点
Haelan 951是大豆蛋白浓缩液,以特别培育的大豆精制而成。厂家通过获得专利的发酵技术将大豆中的植物化学成分被分解成分子单位,以提高它们在人体内的生物利用度。制作一瓶Haelan 951需要12公斤大豆。
Haelan 951中含有具有生物活性的异黄酮:染料木素、黄豆苷和染料木苷,以及饱和支链脂肪酸MDT13[13-甲基-十四烷酸](Kousidou O等人,2006)。活性物质MDT-13展示出了诱导肿瘤细胞凋亡和抗癌活性(Yang Z等人,2000)。
Haelan 951和阿霉素 |
本研究选定基因的描述和作用
本研究的重点是在阿霉素和/或Haelan 951联合治疗BT474细胞株的过程中诱导差异基因表达。表1总结了受诱导的基因。
材料和方法:
受测物质/药品
Haelan 951:有机非转基因大豆。发酵大豆饮料,中国制造,Haelan有限公司分销(美国华盛顿州伍丁维尔Bldg F,142号大街N.E. 18568号,邮编98072,www.haelan951.com)
阿霉素: 赫素公司阿霉素10溶液,活性物质:5 ml药瓶中含10 mg盐酸阿霉素 (2 ug/ul)。抗生素,抗癌药。德国赫素制药集团(德国,holzkirchenAG83607)
表1:本研究中所分析的基因的功能 |
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基因 |
作用 |
说明 |
GAPDH |
管家基因 |
在每种细胞中都大量表达。作为参考基因使用,用于校准(=标准化)其它基因。测定GAPDH需要活细胞,所以死细胞不能用于标准化。 |
Bax |
凋亡基因 |
线粒体膜蛋白,作为BCL2拮抗剂促进凋亡。 |
BCL2 |
凋亡基因 |
线粒体膜蛋白,具抗凋亡作用,由Bax控制。BCL2和Bax的比例对凋亡情况的评估非常重要。 |
Topo lla |
核酸合成 |
在转录、复制和重组中调节DNA拓扑结构的核酶。通过裂解DNA双链的连接催化超螺旋DNA松弛。在各类肿瘤病人身上都发现了拓扑异构酶lla表达的变化。 |
MDR1 |
外排泵 |
MDR1(P-糖蛋白)是一种膜蛋白,在解毒中针对各种药物(包括阿霉素)和外源性物质发挥外排泵的作用。MDR1在肿瘤细胞中的过度表达会导致多药耐药性。 |
ERBB2 |
生长信号受体 |
ERBB2(Her2/neu)是细胞表面受体酪氨酸激酶,和细胞生长以及分化有关。ERRB2在各种肿瘤实体中都常会过度表达,包括乳腺癌。
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表2: BT474细胞株的特征 |
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细胞株 |
来源和说明 |
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BT474 |
人乳腺癌细胞株 人乳腺导管癌DSMZno.:ACC64。来源:从60岁妇女的侵润性乳腺导管癌实体中培养而来。据研究,细胞在无胸腺小鼠体内有致癌作用,且易受小鼠乳腺癌病毒的攻击。参考:国立癌症研究所杂志,Lasfargues等人,1978,61:967 寄存者:H. Kirchner博士,汉诺威医学院,德国汉诺威。DSMZ细胞培养数据 形态学:粘性上皮细胞斑块,中间厚边缘薄的单株 培养基:80%日平米1640+20%FBS+10 ug/ml人胰岛素+2 mM左旋谷酰胺。温育: |
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表3:2 ml培养基中加入的阿霉素(DOX)的总量[2 ug/ul]
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表4:2 ml培养基中加入的Haelan 951【】的总量[2 ug/ul]
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细胞株
细胞株BT474从德国菌种保藏中心的德国国家生物材料资源中心购买。表2总结了BT474细胞株的特征。
细胞株培养条件
BT474细胞根据供应商的建议培养(表2)。细胞在组织培养瓶里与培养,在近汇合的时候用胰蛋白酶消化收获。在牛鲍计数板用显微镜视测计数测定细胞数目。将细胞悬液加入24孔细胞培养板(德国葛莱娜(Greiner)生产的Cellstar牌),每孔密度1X105。加入含有受测物质的培养基,在37℃,5%CO2的条件下培养细胞3天(72小时)。培养后用胰蛋白酶消化收获,提取核糖核酸。培养中定时用显微镜监控受测物质引起的形态学变化。
核糖核酸(RNA)提取和逆转录
根据制造商的建议,用市售Qiamp RNA BloodMinikit(德国快而精公司),Qia shredder柱和Qia-spin柱提取全RNA。使用随即引物和MMLV-逆转录酶将洗脱的全RNA逆转录为cDNA。
基因表达分析
通过利用
最后计算出相对基因表达,计算法方是统一标准化的未受治疗细胞的基因表达值(l)。
表5: 阿霉素(DOX)和Haelan 951(HAL)的各种组合。共有4个浓度的DOX和3个浓度的Haelan 951组合,一共有四个组合系列。途中数字(ul)表示2ml细胞培养基中加入的受测物质。 |
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10DOX 10 HAL |
10DOX 30 HAL |
10DOX 60 HAL |
25DOX 10 HAL |
25DOX 30 HAL |
25DOX 60 HAL |
50DOX 10 HAL |
50DOX 30 HAL |
50DOX 60 HAL
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确定所用受测物质的剂量
为了确定针对肿瘤细胞培养物的单药疗法和联合疗法中受测物质的剂量,必须进行预备试验。为此,我们对在24孔微量滴定板中培养的BT474细胞使用了各种浓度的Haelan 951或阿霉素。模拟治疗的对照组(没有加入受测物质的细胞培养物)使用的是磷酸盐缓冲液(PBS)。最终浓度组的选择依据是预备试验中可观察到的形态学改变和GAPDH表达下降。形态学改变的显微照片入图2所示。根据预备试验选定的受测物质浓度组如表3,4,5所示。
结果
受测物质对细胞活性的影响
在逐渐增加阿霉素、Haelan 951以及混合物浓度(表3-5)的情况下将BT474细胞培养三天.从滴定板上收获细胞并提取RNA后,用定量RT-PCR测定每组细胞培养物的GAPDH的表达情况。GAPDH只在活细胞里表达,所以它可以作为细胞活性和生存率的分子细胞计数器。
如图1所示,各种治疗方法都以剂量依赖的方式降低了BT474细胞的活性:
a. 阿霉素:GAPDH的表达反应出阿霉素让细胞活性大为降低(图
b. Haelan 951:活细胞的数量随Haelan 951浓度的升高而下降。和没有治疗的细胞培养物相比,活细胞的数量在加入30 ul Haelan 951和60ul Haelan 951的培养物中分别下降了5倍和10倍。
c. 阿霉素/ Haelan 951:在阿霉素浓度不变的情况下加入不同浓度的Haelan 951(表5)。活肿瘤细胞的数量随Haelan 951浓度的上升稳步下降(图
受测物质对细胞形态学的影响
如果BT474细胞在普通条件下培养,那么它们会长成巨大的不规则形状(图
图1:手册物质对BT474细胞活性的影响。管家基因GAPDH的相对基因表达有所下降,反映出了细胞活力的下降。加入培养基之后,阿霉素和Haelan 951都展现出了剂量依赖的细胞毒性(1a、1b)。两者混合之后还展现出了协效细胞毒性(
a. 阿霉素对GAPDH表达的影响
受测物质对Bcl2表达的影响
a. 阿霉素:阿霉素对Bcl2表达的影响非常显著。随着阿霉素浓度的增加,Bcl2的表达值急速下降(图
b. Haelan 951:接触Haelan 951的细胞中也出现了抗凋亡基因Bcl2表达的大幅度调低,相比未处理的细胞降低了18倍(图3b)。
c. 阿霉素/ Haelan 951:在浓度较低(10ul)的阿霉素里分别加入30 ul和60 ul的Haelan 951亦可加强Bcl2表达的调低(图
b. Haelan 951对GAPDH表达的影响
a. 阿霉素:阿霉素对促凋亡Bax的表达影响不大(图
b. Haelan 951: 和阿霉素相反,Haelan 951对BT474细胞中的促凋亡Bax的表达有剂量依赖的上调作用(图4b)。相比未处理的细胞培养物,60ul的Haelan 951会让细胞培养物的Bax表达提高4倍。
c. 阿霉素/Haelan 951:使用阿霉素之后,Haelan 951的Bax诱导作用依然存在(图
受测物质对拓扑异构酶II表达的影响
a. 阿霉素:只有高浓度的阿霉素才能让拓扑异构酶IIa的表达降低,而低浓度的阿霉素甚至会让表达略为升高(图
b. Haelan 951:和阿霉素不同,中等剂量的Haelan 951就可以让拓扑异构酶IIa的表达大幅度降低。而且Haelan 951不会使拓扑异构酶IIa表达增加。和未处理的细胞培养物相比,30 ul的Haelan 951可以让表达下调为1/5 (图5b)。
c. 阿霉素/Haelan 951:联合使用的效果和单药疗法类似。低剂量和中等剂量的阿霉素与低剂量的Haelan 951组合后,拓扑异构酶II的表达上升(图
受测物质对MDR1表达的影响
a. 阿霉素:增高阿霉素的剂量可以大幅度上调多药耐药基因MDR1的表达。虽然最低剂量的作用不明显,但剂量上升的时候MDR1的表达也会稳步增加。在100DOX下,MDR1的表达会增加17倍(图
b. Haelan 951: Haelan 951对MDR1的诱导作用没有阿霉素那么强。只有在最高剂量下才会使表达增高4.5倍。最低剂量的Haelan 951甚至会使表达下调(图6b)。
c. 阿霉素/Haelan 951:有趣的是,Haelan 951和阿霉素的联合使用极大抑制了阿霉素在BT474细胞中的MDR1的诱导作用。25DOX和50DOX在单药治疗中会诱导2-10倍的MDR1过表达,但是和Haelan 951联合使用之后,即使最低的Haelan 951也能抑制阿霉素的诱导作用(图
图2: 一般条件下培养的BT474细胞的形态(a)
Haelan 951和阿霉素联合处理后的细胞形态(30HAL 25DOX)(b)
受测物质对ERBB2表达的影响
a. 阿霉素:阿霉素会以剂量依赖的方式降低BT474细胞培养物的ERBB2表达。随着阿霉素剂量的上升,该基因的表达稳步下降。在≧75DOX下,表达减少到了对照组的1/10(图
b. Haelan 951:Haelan 951对ERBB2的作用没有阿霉素这么强烈。中低剂量的Haelan 951(10HAL,30HAL)几乎没有影响。只有高剂量(60HAL)会让ERBB2的表达水平下降2倍左右(图7b)。
c. 阿霉素/Haelan 951:总得来说,联合用药对ERBB2表达的影响和单独用药相似。Haelan 951不会加强阿霉素对ERBB2的调低作用。但是,阿霉素对ERBB2的调低作用也不会受到Haelan 951的抑制(图
图3:受测物质对Bcl2表达的影响
a. 阿霉素对Bcl2表达的影响
讨论
目前的化疗通常都要求使用多种药物。虽然联合治疗加强了抗癌作用,但毒副作用增高成了联合治疗的一大问题。因此,必须在临床试验中决定优化的治疗的方案,以便获得更好的抗肿瘤作用并减少副作用。
本研究评估了阿霉素和Haelan 951联合抗癌治疗的可能性。模型系统是乳腺癌细胞株BT474,培养基中加入了阿霉素,或阿霉素和Haelan 951的混合物。在单独用药中,阿霉素和Haelan 951都使癌细胞的存活率随药物浓度增加而成比例下降。两种物质都展现出了细胞毒性作用。
和Haelan 951混合之后,低剂量的阿霉素也可以达到高剂量的杀灭癌细胞作用。同样的,卡尔马诺斯癌症研究所发表的论文中提到使用阿霉素和大豆里的染料木素联合处理乳腺癌细胞MBA-MB231时,细胞生长抑制作用和凋亡诱导作用都大为加强(Li Y等人,2005)。
图4:受测物质对Bax表达的影响
a. 阿霉素对Bax表达的影响
联合治疗的主要作用是营销凋亡标志物Bcl2和Bax的表达水平。在阿霉素剂量相对较低的情况下,Haelan 951可以增强针对Bcl2表达的下调作用。联合治疗可以让阿霉素达到更高剂量下才能获得抗凋亡基因Bcl2表达抑制作用。
另外,与单独使用阿霉素相比,阿霉素和Haelan 951的混合物将促凋亡基因Bax的表达水平提到了2-3倍。因此,联合治疗通过下调抗凋亡基因(Bcl2)的表达和上调促凋亡基因(Bax)的表达加强了BT474细胞的凋亡条件。治疗提高了Bax/bcl2的比例,这是加强细胞凋亡条件的决定性因素。卡尔马诺斯癌症研究所也证明了大豆异黄酮染料木素通过提高Bax/Bcl2的比例使淋巴瘤细胞对化疗更敏感(Mohammad RM等人,2003)。
受测物质对拓扑异构酶IIa展示出了有趣的作用。BT474细胞株充分表达拓扑异构酶IIa,为拓扑异构酶IIa抑制剂阿霉素提供了充足的作用靶点。想阿霉素中加入更多Haelan 951可以增强拓扑异构酶IIa表达的下调。这一作用在阿霉素剂量不高时尤为明显,此时加入Haelan951会获得最显著的增强作用。一项涉及33名乳腺癌患者的临床研究表明,响应阿霉素治疗的患者都出现了拓扑异构酶IIa表达大幅度下降。相反,没有响应的患者在治疗结束后出现了拓扑异构酶IIa表达增高(Arpino等人,2005)。另一项研究发现,基于蒽环霉素的新辅助化疗法让表达拓扑异构酶IIa的细胞大为减少(Tinari等人,2006)。大豆异黄酮染料木素可以抑制拓扑异构酶IIa(Markovits J等人,1989)。
拮抗阿霉素化疗的主要因素是MDR1基因。MDR1发挥外排泵的作用,会通过加强细胞对有毒物质的排泄诱导多药抗药性(Borst P等人,2002)。阿霉素的剂量越是增加,BT474细胞中MDR1的表达就越是升高。相反,Haelan 951在最高测试剂量下也不会诱导MDR1的表达。最重要的是,如果阿霉素中加入Haelan 951,那阿霉素诱导MDR1表达的作用基本上就会消失。即使在让MDR1过表达17倍的最高测试浓度下,加入Haelan 951也能减少MDR1的表达。在临床事件中,MDR1相关的多药抗药性是化疗的主要障碍。因此药理学研究中评估了很多对抗阿霉素诱导MDR1的办法。例如,用丙烯酸盐纳米球胶囊包覆阿霉素可以减轻诱导作用(Laurand A等人,2004)。
在乳腺癌中,ERBB2的过表达会导致恶性转化和不良预后。本研究中使用的BT474细胞扩增了ERBB2,会导致过表达。ERBB2的表达会随阿霉素剂量的增高而增高。Haelan 951和阿霉素联合使用既不会增强也不会减弱对ERRB2的下调作用。因此Haelan 951对BT474的ERBB2表达并无明显作用。日本国家健康营养研究所的研究表明,用阿霉素和染色木素治疗过表达ERBB2的乳腺癌细胞可以获得增强的细胞毒性并灭活ERBB2。但研究没有阐明这样的作用是来自阿霉素还是染色木素。
避免化疗严重副作用的一大策略是“节拍疗法”,即使用低剂量药物,但以较短的间隔多次给药(Gille J等人,2005)。我们的研究表明,和Haelan 951一起使用的话,减少阿霉素的剂量也可以取得同样的疗效。
化疗药物会首先影响增殖细胞和组织,因此肿瘤组织里新生成的血管可称为低剂量治疗策略的靶点。更深入的研究可能会证明Haelan 951还可以加强抑制肿瘤新血管生成药物的作用。
阿霉素的主要副作用之一是心脏毒性,因为它会催化活性超氧游离基的生成,使抗氧化性不强的组织受到伤害,比如心脏。现已证明大豆异黄酮具有抗氧化能力,可以抑制阿霉素诱导的大鼠心衰(Ma SF等人,2004)。因此,Haelan951和阿霉素的联合使用可以降低化疗的毒副作用,造福患者。
总结
·在培养基中增加阿霉素和Haelan 951的浓度会使BT474细胞的存活率明显下降。在阿霉素中加入Haelan951会使肿瘤细胞活性呈剂量依赖性下降,说明阿霉素和Haelan 951有协效作用。
·阿霉素以剂量依赖的方式一致抗凋亡基因Bcl2的表达。和Haelan951联合使用的时候,浓度较低的阿霉素也可以达到高浓度阿霉素单独使用时的Bcl2抑制效果。
阿霉素单独使用时对促凋亡基因Bax的表达作用不大。但是和Haelan 951联合使用时可以将Bax的表达水平提高2-3倍。Bax/Bcl2比例的增加表明肿瘤细胞凋亡条件得到了加强。
· 阿霉素细胞毒性的基础是抑制细胞拓扑异构酶II,所以可以将拓扑异构酶II看做阿霉素的靶点。只有高浓度的阿霉素才能下调拓扑异构酶IIa的表达。但是中浓度的Haelan 951在单独使用或和阿霉素联合使用时都可以大幅度下调拓扑异构酶IIa的表达。最近的一项临床研究表明,拓扑异构酶IIa的表达在响应阿霉素疗法的乳腺癌患者体内大幅度下降,但在不响应的患者体内有所增加。
·肿瘤细胞中高浓度的MDR1会通过加强药物外派而导致针对阿霉素和其它诸多化疗药物的多药抗药性。对BT474细胞使用阿霉素时可以观察到剂量依赖性的MDR1表达增高。另一方面,只有极高剂量的Haelan 951才会诱导MDR1的表达。有趣的是,向阿霉素里加入Haelan 951之后几乎可以消除阿霉素对MDR1表达的剂量依赖上调。因此可以推断,化疗药和Haelan 951联合使用即可减少MDR1相关的多药抗药性。
·阿霉素单独使用和阿霉素/Haelan 951联合使用对ERBB2的影响没有区别。
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